Użu u prekawzjonijiet ta 'tubu ċentrifugu ta' ultrafiltrazzjoni
1) Agħżel tubu ta 'ultrafiltrazzjoni adattat.Innota li l-membrani UF huma differenti fil-livell tagħhom ta 'tolleranza għal diversi kimiċi.Tipikament, tubi ta 'ultrafiltrazzjoni b'qtugħ ta' piż molekulari ta '10 kDa jistgħu jintgħażlu b'qtugħ ta' piż molekulari li m'għandux ikun akbar minn 1 / 3 tal-piż molekulari tal-proteina ta 'interess, bħal 35 kDa.Jekk il-piż molekulari tal-proteina ta 'interess huwa ta' madwar 10 kd, jista 'jintuża tubu ta' ultrafiltrazzjoni b'cut-off tal-piż molekulari ta '3 KD.
(2) L-ultrafiltrazzjoni, mixtrija friska, hija niexfa, b'ilma ultrapur miżjud qabel l-użu u ilma mgħoddi kompletament mill-membrana, banju tas-silġ jew friġġ imkessaħ minn qabel għal ftit minuti.L-ilma mbagħad jitferra ', jiġifieri l-likwidu tal-proteina, u kemm huwa miżjud, liema minnhom ma jkunx aktar mil-linja bajda fil-quċċata tat-tubu.L-operazzjoni hija ħafifa, u t-tubu tal-ultrafiltrazzjoni jeħtieġ li jiġi mkessaħ minn qabel fuq is-silġ qabel ma żżid is-soluzzjoni tal-proteina.
3) Kemm il-massa kif ukoll iċ-ċentru tal-gravità kellhom jilħqu l-bilanċ.Innota li l-veloċità rotazzjonali u l-aċċelerazzjoni mhumiex veloċi ħafna, inkella jagħmlu ħsara diretta lill-membrana tal-ultrafiltrazzjoni.Inbdiet ultrafiltrazzjoni ċentrifugali (ċentrifuga mkessħa minn qabel għal 4 gradi).Wara li l-RPM ta 'ċentrifugi differenti ġie kkonvertit għal g, kien differenti.L-aċċelerazzjoni taċ-ċentrifuga ġiet aġġustata għall-minimu, u tnaqqas il-pressjoni fuq il-membrana.Innota, kun żgur li tħalli ċ-ċentrifuga wara li ċ-ċentrifuga tkun laħqet il-veloċità tad-destinazzjoni tagħha, jew jekk għandek problema, ma tistax timmaniġġaha għall-ewwel darba.L-orjentazzjoni tal-membrana lejn il-magħżel ġiet aġġustata skond l-istruzzjonijiet (il-każ ta 'ċentrifuga angolari huwa membrana għall-assi perpendikolari).Fl-użu prattiku, il-veloċità tar-rotazzjoni ġenerali hija aktar baxxa minn dik fl-istruzzjonijiet, sabiex il-ħajja tat-tubu ċentrifugu tkun tista 'tiġi estiża.
3) Kemm il-massa kif ukoll iċ-ċentru tal-gravità kellhom jilħqu l-bilanċ.Innota li l-veloċità rotazzjonali u l-aċċelerazzjoni mhumiex veloċi ħafna, inkella jagħmlu ħsara diretta lill-membrana tal-ultrafiltrazzjoni.Inbdiet ultrafiltrazzjoni ċentrifugali (ċentrifuga mkessħa minn qabel għal 4 gradi).Wara li l-RPM ta 'ċentrifugi differenti ġie kkonvertit għal g, kien differenti.L-aċċelerazzjoni taċ-ċentrifuga ġiet aġġustata għall-minimu, u tnaqqas il-pressjoni fuq il-membrana.Innota, kun żgur li tħalli ċ-ċentrifuga wara li ċ-ċentrifuga tkun laħqet il-veloċità tad-destinazzjoni tagħha, jew jekk għandek problema, ma tistax timmaniġġaha għall-ewwel darba.L-orjentazzjoni tal-membrana lejn il-magħżel ġiet aġġustata skond l-istruzzjonijiet (il-każ ta 'ċentrifuga angolari huwa membrana għall-assi perpendikolari).Fl-użu prattiku, il-veloċità tar-rotazzjoni ġenerali hija aktar baxxa minn dik fl-istruzzjonijiet, sabiex il-ħajja tat-tubu ċentrifugu tkun tista 'tiġi estiża.
(4) Meta kkonċentrat għall-1ml li jifdal, ħu 50ul ta 'soluzzjoni buffer, żid 10ul ta' fluss u ara jekk hemmx xi kulur blu, bħala ġudizzju jekk it-tubu ta 'ultrafiltrazzjoni għandux proteina.Jekk it-tubu jkun leaky, erġa ferra s-saff ta 'fuq u flowthrough ġo tubu ġdid biex tibda l-ultrafiltrazzjoni.Biex tiddetermina b'mod preċiż jekk it-tubi intilfux, ċentrifuga għal 10min b'5mgml ta' BSA qabel il-flowthrough, taħdem fuq kolla tal-proteini, jew assaġġ mhux raffinat Bradford, u kompli billi żżid is-soluzzjoni ta' proteina kkonċentrata li jifdal (li topera fuq is-silġ u tipprevjeni li l-proteini jisħnu) sakemm il-konċentrat kollu ġie miżjud.Oqgħod attent waqt iċ-ċentrifugazzjoni jekk isseħħ preċipitazzjoni tal-proteini, li twassal għall-għeluq tat-tubu.Jekk isseħħ preċipitazzjoni, iddetermina jekk il-kawża speċifika tal-preċipitazzjoni hijiex konċentrazzjoni eċċessiva ta 'proteina jew buffer mhux xieraq;L-ewwel jista 'jiġi solvut permezz ta' ultrafiltrazzjoni ta 'tubi ta' ultrafiltrazzjoni multipli simultanjament, titnaqqas il-konċentrazzjoni, u tal-aħħar billi tiskambja soluzzjonijiet buffer differenti sakemm ma sseħħ l-ebda preċipitazzjoni tal-proteina.
(4) Meta kkonċentrat għall-1ml li jifdal, ħu 50ul ta 'soluzzjoni buffer, żid 10ul ta' fluss u ara jekk hemmx xi kulur blu, bħala ġudizzju jekk it-tubu ta 'ultrafiltrazzjoni għandux proteina.Jekk it-tubu jkun leaky, erġa ferra s-saff ta 'fuq u flowthrough ġo tubu ġdid biex tibda l-ultrafiltrazzjoni.Biex tiddetermina b'mod preċiż jekk it-tubi intilfux, ċentrifuga għal 10min b'5mgml ta' BSA qabel il-flowthrough, taħdem fuq kolla tal-proteini, jew assaġġ mhux raffinat Bradford, u kompli billi żżid is-soluzzjoni ta' proteina kkonċentrata li jifdal (li topera fuq is-silġ u tipprevjeni li l-proteini jisħnu) sakemm il-konċentrat kollu ġie miżjud.Oqgħod attent waqt iċ-ċentrifugazzjoni jekk isseħħ preċipitazzjoni tal-proteini, li twassal għall-għeluq tat-tubu.Jekk isseħħ preċipitazzjoni, iddetermina jekk il-kawża speċifika tal-preċipitazzjoni hijiex konċentrazzjoni eċċessiva ta 'proteina jew buffer mhux xieraq;L-ewwel jista 'jiġi solvut permezz ta' ultrafiltrazzjoni ta 'tubi ta' ultrafiltrazzjoni multipli simultanjament, titnaqqas il-konċentrazzjoni, u tal-aħħar billi tiskambja soluzzjonijiet buffer differenti sakemm ma sseħħ l-ebda preċipitazzjoni tal-proteina.
(5) L-ewwel ftit passi jintużaw biex tikkonċentra l-proteina, u jekk il-buffer għandu jinbidel, żid bil-mod buffer ġdid (ultrafiltrazzjoni permezz ta 'membrana ta' ultrafiltrazzjoni 0.22um) għal madwar 1ml ta 'proteina totali, u ikkonċentra mill-ġdid għal madwar 1ml għal tlieta. darbiet konsekuttivi, bil-volum finali konċentrat finali jiddependi fuq il-konċentrazzjoni ta 'proteina mixtieqa, ġeneralment mhux aktar minn 500ul, iżda wkoll sa 200ul.Ikseb 1000 × jew aktar fi tliet okkażjonijiet, essenzjalment l-istess bidla fil-buffer, kif ikkalkulat minn tal-inqas 10 × jew aktar arrikkiment tal-volum kull darba.
(5) L-ewwel ftit passi jintużaw biex tikkonċentra l-proteina, u jekk il-buffer għandu jinbidel, żid bil-mod buffer ġdid (ultrafiltrazzjoni permezz ta 'membrana ta' ultrafiltrazzjoni 0.22um) għal madwar 1ml ta 'proteina totali, u ikkonċentra mill-ġdid għal madwar 1ml għal tlieta. darbiet konsekuttivi, bil-volum finali konċentrat finali jiddependi fuq il-konċentrazzjoni ta 'proteina mixtieqa, ġeneralment mhux aktar minn 500ul, iżda wkoll sa 200ul.Ikseb 1000 × jew aktar fi tliet okkażjonijiet, essenzjalment l-istess bidla fil-buffer, kif ikkalkulat minn tal-inqas 10 × jew aktar arrikkiment tal-volum kull darba.
Ħin tal-post: Nov-09-2022