PCR, hija r-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi, li tirreferi għaż-żieda ta 'dNTP, Mg2+, fatturi ta' elongazzjoni u fatturi ta 'titjib tal-amplifikazzjoni għas-sistema taħt il-katalisi tad-DNA polimerażi, bl-użu tad-DNA ġenitur bħala mudell u primers speċifiċi bħala l-punt tat-tluq tal-estensjoni , Permezz tal-passi ta 'denaturazzjoni, ittemprar, estensjoni, eċċ., Il-proċess ta' replikazzjoni in vitro tad-DNA tal-linja bint kumplimentari għad-DNA tal-mudell tal-linja ġenitur jista 'malajr u speċifikament jamplifika kwalunkwe DNA fil-mira in vitro.
1. Hot Start PCR
Il-ħin tal-bidu tal-amplifikazzjoni fil-PCR konvenzjonali mhuwiex li tpoġġi l-magna tal-PCR fil-magna tal-PCR, u mbagħad il-programm jibda jamplifika.Meta titlesta l-konfigurazzjoni tas-sistema, tibda l-amplifikazzjoni, li tista 'tikkawża amplifikazzjoni mhux speċifika, u l-PCR hot-start tista' ssolvi din il-problema.
X'inhu hot start PCR?Wara li titħejja s-sistema ta 'reazzjoni, il-modifikatur tal-enzima jiġi rilaxxat f'temperatura għolja (ġeneralment ogħla minn 90 ° C) matul l-istadju inizjali tat-tisħin tar-reazzjoni jew l-istadju ta' "bidu sħun", sabiex id-DNA polimerażi tiġi attivata.Il-ħin eżatt ta' attivazzjoni u t-temperatura jiddependu fuq in-natura tad-DNA polymerase u l-modifikatur hot-start.Dan il-metodu juża prinċipalment modifikaturi bħal antikorpi, ligandi ta 'affinità, jew modifikaturi kimiċi biex jinibixxu l-attività tad-DNA polymerase.Peress li l-attività tad-DNA polymerase hija inibita f'temperatura tal-kamra, it-teknoloġija tal-bidu sħun tipprovdi konvenjenza kbira għall-preparazzjoni ta 'sistemi ta' reazzjoni PCR multipli f'temperatura ambjentali mingħajr ma tiġi sagrifikata l-ispeċifiċità tar-reazzjonijiet PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) hija teknika sperimentali għat-traskrizzjoni inversa minn mRNA għal cDNA u tużaha bħala mudell għall-amplifikazzjoni.Il-proċedura sperimentali hija li jiġi estratt l-RNA totali f'tessuti jew ċelloli l-ewwel, uża Oligo (dT) bħala primer, uża reverse transcriptase biex tisintetizza cDNA, u mbagħad tuża cDNA bħala mudell għall-amplifikazzjoni tal-PCR biex tikseb il-ġene fil-mira jew tiskopri l-espressjoni tal-ġene.
3. PCR kwantitattiv fluworexxenti
PCR kwantitattiv fluworexxenti (PCR Kwantitattiv f'ħin reali,RT-qPCR) tirreferi għall-metodu ta 'żieda ta' gruppi fluworexxenti mas-sistema ta 'reazzjoni tal-PCR, bl-użu tal-akkumulazzjoni ta' sinjali fluworexxenti biex jimmonitorja l-proċess kollu tal-PCR f'ħin reali, u finalment bl-użu tal-kurva standard biex tanalizza kwantitattivament il-mudell.Metodi qPCR komunement użati jinkludu SYBR Green I u TaqMan.
4. PCR nested
PCR nested tirreferi għall-użu ta 'żewġ settijiet ta' primers PCR għal żewġ rawnds ta 'amplifikazzjoni PCR, u l-prodott ta' amplifikazzjoni tat-tieni rawnd huwa l-framment tal-ġene fil-mira.
Jekk nuqqas ta 'qbil tal-ewwel par ta' primers (primers ta 'barra) jikkawża li prodott mhux speċifiku jiġi amplifikat, il-possibbiltà li l-istess reġjun mhux speċifiku jiġi rikonoxxut mit-tieni par ta' primers u li jkompli jamplifika hija żgħira ħafna, għalhekk il- amplifikazzjoni mit-tieni par ta 'primers, l-ispeċifiċità tal-PCR ġiet imtejba.Vantaġġ wieħed tat-twettiq ta 'żewġ rawnds ta' PCR huwa li jgħin biex jamplifika prodott suffiċjenti minn DNA tal-bidu limitat.
5. PCR tal-illandjar
Il-PCR tal-illandjar huwa metodu biex tittejjeb l-ispeċifiċità tar-reazzjoni tal-PCR billi taġġusta l-parametri taċ-ċiklu tal-PCR.
Fil-PCR tal-illandjar, it-temperatura tal-ittemprar għall-ewwel ftit ċikli hija ssettjata ftit gradi 'l fuq mit-temperatura massima tal-ittemprar (Tm) tal-primers.Temperatura ogħla ta 'ttemprar tista' tnaqqas b'mod effettiv l-amplifikazzjoni mhux speċifika, iżda fl-istess ħin, temperatura ogħla ta 'ttemprar se taggrava s-separazzjoni ta' primers u sekwenzi fil-mira, li tirriżulta f'rendiment ta 'PCR imnaqqas.Għalhekk, fl-ewwel ftit ċikli, it-temperatura ta 'l-ittemprar hija ġeneralment issettjata biex tonqos b'1 ° C għal kull ċiklu biex iżid il-kontenut tal-ġene fil-mira fis-sistema.Meta t-temperatura tal-ittemprar titbaxxa għall-aħjar temperatura, it-temperatura tal-ittemprar tinżamm għaċ-ċikli li jifdal.
6. PCR dirett
Il-PCR dirett jirreferi għall-amplifikazzjoni tad-DNA fil-mira direttament mill-kampjun mingħajr il-ħtieġa ta 'iżolament u purifikazzjoni tal-aċidu nuklejku.
Hemm żewġ tipi ta 'PCR dirett:
metodu dirett: ħu ammont żgħir ta 'kampjun u żidha direttament mal-PCR Master Mix għall-identifikazzjoni tal-PCR;
metodu ta 'qsim: wara li tieħu l-kampjun tal-kampjun, żidha mal-lysate, lyse biex tirrilaxxa l-ġenoma, ħu ammont żgħir ta' supernatant lysed u żidha ma 'PCR Master Mix, wettaq identifikazzjoni PCR.Dan l-approċċ jissimplifika l-fluss tax-xogħol sperimentali, inaqqas il-ħin hands-on, u jevita t-telf tad-DNA waqt il-passi ta 'purifikazzjoni.
7. SOE PCR
It-twaħħil tal-ġeni permezz tal-PCR ta' estensjoni ta' sovrapożizzjoni (SOE PCR) juża primers bi truf komplementari biex il-prodotti tal-PCR jiffurmaw ktajjen li jikkoinċidu, sabiex fir-reazzjoni ta 'amplifikazzjoni sussegwenti, permezz tal-estensjoni tal-ktajjen li jikkoinċidu, sorsi differenti ta' teknika A li fiha frammenti amplifikati huma sovrapposti. u magħqudin flimkien.Din it-teknoloġija bħalissa għandha żewġ direzzjonijiet ewlenin ta 'applikazzjoni: kostruzzjoni ta' ġeni ta 'fużjoni;mutazzjoni diretta lejn is-sit tal-ġeni.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) juża primers komplementari inversi biex jamplifika frammenti tad-DNA minbarra ż-żewġ primers, u jamplifika sekwenzi mhux magħrufa fuq iż-żewġ naħat ta 'framment tad-DNA magħruf.
IPCR kien oriġinarjament iddisinjat biex jiddetermina s-sekwenza ta 'reġjuni mhux magħrufa adjaċenti, u huwa l-aktar użat biex jistudja sekwenzi promoturi tal-ġeni;riarranġamenti tal-kromożomi onkoġeniċi, bħall-fużjoni tal-ġeni, it-traslokazzjoni u t-traspożizzjoni;u l-integrazzjoni tal-ġeni virali, huma wkoll komunement użati issa Għal mutaġenesi diretta lejn is-sit, ikkopja plasmid bil-mutazzjoni mixtieqa.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) hija teknika għall-kwantifikazzjoni assoluta tal-molekuli tal-aċidu nuklejku.
Bħalissa hemm tliet metodi għall-kwantifikazzjoni tal-molekuli tal-aċidu nuklejku.Il-fotometrija hija bbażata fuq l-assorbiment tal-molekuli tal-aċidu nuklejku;PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali (PCR f'ħin reali) huwa bbażat fuq il-valur Ct, u l-valur Ct jirreferi għan-numru taċ-ċiklu li jikkorrispondi għall-valur tal-fluworexxenza li jista 'jiġi skopert;PCR diġitali hija l-aħħar teknoloġija kwantitattiva bbażata fuq metodu PCR ta 'molekula waħda għall-għadd ta' kwantifikazzjoni ta 'aċidu nuklejku huwa metodu kwantitattiv assolut.
Ħin tal-post: Ġunju-13-2023